غربالگری و جداسازی بخشی از ژن های سنتزکننده ی پپتیدهای غیرریبوزومی در اکتینومیست های جداشده از خاک های ایران

چکیده پپتیدهای غیرریبوزومی توسط باکتری ها و برخی از موجودات عالی مثل حشرات تولید می شوند و کاربردهای درمانی، کشاورزی، صنعتی، تولیدی و ... بسیار متنوعی از جمله: سیدروفور، رنگ دانه، توکسین، آنتی بیوتیک، آنتی تومور، سرکوبگر سیستم ایمنی، تمایز سلولی، ویتامین و ... دارند. این پپتیدها به وسیله ی آنزیم های سنتزکننده ی پپتیدهای غیرریبوزومی تولید می شوند. این آنزیم های بزرگ که از کمپلکس های پروتئینی با چندین زیرواحد تشکیل شده اند، توسط یک یا چند ژن سازمان یافته در خوشه های ژنی تولید می شوند و به عنوان الگو و سنتزکننده ی پپتیدهای غیر ریبوزومی عمل می کنند. این آنزیم ها از چندین مدول تشکیل شده اند. هر مدول یک اسیدآمینه را فعال می کند و آن را در رشته ی درحال سنتز قرار می دهد. مدول از چندین دومین تشکیل شده است که فعالیت های آنزیمی آن را انجام می دهند. پژوهش های انجام شده بر روی ژن های آنزیم های سنتزکننده ی پپتیدهای غیرریبوزومی مربوط به اکتینومیست ها در کلکسیون میکروارگانیسم های دانشگاه تهران نشان داده است که تعدادی از این باکتری های جداشده از خاک های ایران دارای ژن های مهمی هستند که تا کنون در بانک ژنی ثبت و بررسی نشده اند. با توجه به بررسی های به عمل آمده، این ژن ها پتانسیل های بالقوه ای در تولید داروها و متابولیت های مفید و جدید دارند. با توجه به اهمیت و کاربرد این پپتیدها، در این پژوهش با شناسایی بخشی از توالی خوشه های ژنی آنزیم های سنتز کننده ی چند پپتید غیرریبوزومی، از اکتینومیست های مولد آن ، توالی های نوکلئوتیدی جدیدی درجهت رسیدن به پپتیدهای غیرریبوزومی جدید، شناسایی شد. در این تحقیق، ابتدا باکتری های انتخاب شده که طبق پژوهش های قبلی دارای ژن آنزیم سنتزکننده ی پپتید غیرریبوزومی هستند، کشت داده شدند و بعد از رسیدن به شرایط مناسب، dna آن ها استخراج شد. در مرحله ی بعد با استفاده از اطلاعات به دست آمده در مورد نواحی ژنی حفاظت شده ی آنزیم های سنتزکننده ی پپتیدهای غیرریبوزومی، پرایمرهای دژنره ی خاصی برای این نواحی طراحی شد. توالی هایی تا اندازه ی 2kb توسط این پرایمرها به وسیله ی واکنش pcr تکثیر شد. در نهایت محصول pcr پس از خالص سازی از ژل الکتروفورز آگاروز، توالی یابی و آنالیز شد. بررسی های انجام شده نشان داد این توالی ها متعلق به خوشه های ژنی آنزیم های سنتزکننده ی پپتیدهای غیرریبوزومی هستند و شامل نواحی ژنی کدکننده ی دومین pcp و بخش مهمی از دومین a می باشند. همچنین با بررسی اسیدآمینه های جایگاه فعال دومین های a درمورد اسیدآمینه های فعال شده توسط آن ها پیش بینی هایی صورت گرفت و در نهایت با کلون کردن تعدادی از ژن های جداشده امکان تولید در مقادیر فراوان و نیز مهندسی مدول ها برای تولید پپتیدهای غیرریبوزومی جدید بررسی شد. واژگان کلیدی: پپتیدهای غیرریبوزومی، آنزیم های سنتزکننده ی پپتیدهای غیرریبوزومی، مدول، دومین، پرایمرهای دژنره